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ELISA具有特异性强 灵敏度高 操作简单等优点,被广泛应用于各种抗原和抗体的测定,为生物科研起到了积极的推动作用.但ELISA测定中影响因素较多,操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响,甚至出现错误的结果.下面主要看一下操作中因素的影响.
操作中的因素
加样：孵育前加样时间过长,酶试剂加出孔外,使用滴瓶滴加试剂时,滴加的角度不同和挤压的力度不同,致使滴加的试剂量不准,都可导致试验结果不准确.控制方法：①实验样本过多时,可分批次操作,以减少实验时间延长造成的误差；②加酶试剂后,用吸水纸吸干孔外试剂；③作定量试验时,使用加样器加注试剂,并经常校正其准确性,此外,要做到一份样本一个移液头,防止交叉污染.
温育：温育是ELISA测定最为关键 最容易出现问题的步骤.最为常见的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2-8℃.目前国内售ELISA试剂盒温育时间为37℃,30 min-1 h,进口ELISA试剂盒则通常为37℃,1-2 h能有较完全的结合.
温育时间 温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间 温度.加完样本和（或）试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃需要一定时间,如果是将微孔板一放入温箱即开始计时,这样就容易造成实际测定中温育时间不够,易致弱阳性标本测不出来.控制方法：①如有两种温度,尽量使用较低的温育温度 较长反应时间的条件；②用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察.
“边缘效应”的排除“边缘效应”是在使用96孔板的ELISA测定中,外周孔显色较中心孔深的现象.产生的原因可能是为96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的,因此在温育时尽量采用水浴.
洗板：ELISA测定的洗板一般有两种方式,即手工和洗板机洗板.采用手工洗板,孔与孔之间液体易交叉,采用半自动洗板机时,洗液量不足导致洗板不彻底,洗板针堵塞导致抽吸不完全,洗板不畅导致清洗效果差.控制方法：①手工洗板时,拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离；②洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅,若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出；③为了洗涤效果好,实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法,在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次,或适当增加洗板的次数,有资料报道洗板7次能达到理想的洗涤效果.
显色：市售ELISA试剂盒中,如以四甲基联苯胺(TMB)为底物,则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以邻苯二胺(OPD)为底物,则试剂盒提供邻苯二胺片剂或粉剂.显色反应条件为37℃或室温反应15-30 min.以邻苯二胺(OPD)为底物的试剂,要临用前30 min配制且必须避光.以四甲基联苯胺(TMB)为底物的试剂则不需避光,但A B液应尽量避免接触金属器械.
结果判定：读取结果要在15-30 min内完成,定性测定用肉眼判读试验结果时,反应板应水平距离白色背景10-15 cm；定量测定时用酶标仪读取结果,酶标仪不应置于阳光或强光照射下,需先预热15-30 min再进行测试.
综上所述,尽管ELISA法操作简单,但可能影响测定结果的因素也较多.故在实际操作的过程中,要加强质量管理,认真避免或减少影响因素,力求结果准确,为科研实验提供可靠的依据.
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