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相信很多人都会有这样的感受,Elisa实验我明明很用心很认真的按照文献或说明书做的,为什么结果却与文献上的数据差距很大呢？经过技术老师多年的实践经验,总结出了以下三点原因：试剂因素,样本因素,操作中的因素.
一 试剂因素
1. 试剂应选择操作步骤简单方便,灵敏度高 特异性好 稳定性好 批间差异小的试剂.
2. 不同厂家的试剂一定不能混用,包括底物 洗涤液和显色剂.因为每个厂家校准标准不同,还有抗体 检测方法 试剂 交叉反应等因素都会导致对样本的检测结果不一致.
3. 要注意试剂的批号和出厂日期,试剂的有效期一般为6个月,实验时最好使用新鲜的,生产日期比较新的.
4. 避免选择质量低劣,假的 ELISA 试剂盒.有些厂家为夸大生产 ELISA 试剂盒的指标范围,用一种在大多数哺乳动物中都有广泛表达的指标来冒充其它指标,造成各种种属 各种指标都可以做的假象.其实这种指标种属间的氨基酸序列同源性达 100%,这种指标随着其他因子的影响,其表达水平也会发生相应的变化,使得实验者难以查觉.
二 标本因素和操作因素
血清是最常用的 ELISA 标本,血浆一般可视为与血清同等的标本,标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致,分为内源性物质和外源性物质两种.
1 内源性干扰因素：包括类风湿因子 补体 高浓度的非特异免疫球蛋白 异嗜性抗体 某些自身抗体等.
类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF),其一般为IgM型,亦有IgG和IgA型,具有与变性IgG产生非特异结合的特点,因为在ELISA测定中,其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果.避免其发生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG.②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理.③检测抗原时,可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解.
补体在固相酶免疫测定中,来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能.一方面,固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构,使Fc段的补体C1q结合点暴露出来,使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果.另一方面,固相抗体也会因为活化补体的结合,封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性.解决的办法是：①用EDTA稀释标本.②56℃ 30 min加热血清使C1q灭活.
2 外源性干扰因素：包括标本溶血 标本被细菌污染 标本保存时间过长和标本凝固不全等.
标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性,因此,在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中,如血清样本中血红蛋白浓度较高,则很容易在温育过程中吸附于固相,从而与后面加入的HRP底物反应显色.所以在采血时应注意手法,采集的血液勿用力振荡,严防标本溶血.
标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶,可使实验出现非特异性显色.因此,ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能当时测定,5 d之内应4℃保存,1周后检测应低温冻存；同时,收集标本采用无菌试管,可防止标本的污染.
标本的保存标本在冰箱中保存过久,血清中IgG可聚合成多聚体,AFP可形成二聚体,在用间接法测定中会导致本底过深,甚至造成假阳性. 冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用,可引起假阴性结果.因此,ELISA检测尽量采用新鲜标本,长时冻存的样本避免反复融冻.
标本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原,可使结果呈假阳性.解决的方法有：①于采血管中加入适当的抗凝剂；②将采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h,待充分凝固后再离心分离血清.
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