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常用的酶联免疫吸附实验原理有哪些?
发布时间:2018/11/7 8:47:07 阅读次数:345

 酶联免疫吸附实验,一般简称为ElisaElisa技术是免疫标记技术的一种,因为具有快速,方便,简单,定性,定量甚至定位的特点,广泛应用于广大科研实验中。下面我们来介绍下常用的几种实验原理。

1, 竞争法

竞争法一般分为直接竞争法和间接竞争法。间接竞争法在常见的实验中用的不是很多,

我们就主要介绍一下直接竞争法的原理。直接竞争法就是将合适的包被抗体包被于微孔板中,

加入无关蛋白载体封闭未结合的位点,然后加入标准品(样本)和生物素标记的抗原物质进行竞争结合,在合适的温度和一定时间的孵育,洗涤,再加入HRP标记的链霉亲和素来进行反应,TMB显色,微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。
  这个方法一般多用来检测具有较少表位的小分子物质。检测大分子抗原物质及抗体时,这种方法也可以用。但是检测大分子抗原时,由于空间位阻的影响,使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高;检测抗体时,可能由于两种竞争的抗体来源不一,导致两种抗体趋同性不高,就会造成检测结果的可靠性不高。

2, 间接法

间接法一般用来检测抗体。间接法是将一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板中,加入无关蛋白载体封闭未结合位点后,加入待测样本,然后加入酶标二抗,过一定的时间孵育和洗涤后,加底物显色。一般而言,在间接法检测抗体实验中,由于酶标二抗的局限性,一般检测的抗体为总的IgG

3, 双抗体夹心法

双抗体夹心法,它是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面,加入无关蛋白载体封闭未结合位点,然后加入待测标本,通过加入检测抗体,酶标记第二抗体后用TMB底物显色,待测物的浓度与微孔板中颜色的深浅呈正相关。
  双抗体夹心法多用于含有多个抗原表位的大分子物质。因为此检测方法需要两种抗体,所以就关系到抗体配对的问题。一般常用的抗体配对方法有下面几种:包被抗体为单抗,检测抗体为单抗,但这两种单抗针对的抗原表位不同;包被抗体为单抗,检测抗体为多抗;包被抗体为多抗,检测抗体为多抗,这两种多抗一般是来源于不同的宿主。

  双抗体夹心法在应用酶标第二抗体时,要注意一个关键是:第二抗体必须只能针对检测抗体,而不能针对包被抗体。由于酶标二抗具有局限性,现在一般厂家都引入生物素亲和素放大系统,这种系统不仅能提高反应灵敏度,而且也更加方便,我们只需对检测抗体进行生物素标记,不需要对每一种不同来源的二抗进行酶标记,只需对亲和素做HRP标记就可以省去很多麻烦的工作。

4, 双抗原夹心法

双抗原夹心法,与双抗体夹心法类似,基本原理是将已知浓度的抗原固定于聚苯乙烯微孔板表面,对未结合位点用无关蛋白载体进行封闭后,加入待测样本,然后加入生物素标记的抗原和HRP标记的链霉亲和素,经TMB显色后终止反应,酶标仪读数之后即可计算待测物浓度。双抗原夹心法与间接法都可以对抗体进行检测,但是前者检测的是针对该抗原的所有种类的抗体,包含IgG, IgM, IgAIgD, IgE,这是间接法做不到的。

 

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